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    影響非洲豬瘟檢測結果的因素分析:樣品的前處理與核酸提取

    2019-08-05

    正確采集、運送、接收和保存樣本是獲得準確、可靠檢驗結果的首要環節,但臨床檢測樣本種類多樣,比如檢測非洲豬瘟病原學樣品就包括:唾液、全血、血清、組織、蜱、環境拭子等。
    不同的樣品需要選擇合適的前處理和核酸提取方法,除去蛋白、脂類和核酸酶等干擾核酸擴增的物質,對保證檢測結果的準確性十分重要。


    其中,核酸提取的成敗關系到臨床PCR檢驗的正確與否,也是最容易出問題的環節。

    圖1.jpg


    而核酸提取又跟樣品的前處理密切相關,不同的樣本類型,樣品的前處理過程會有差異。


    常見樣品的前處理過程(簡化版)


    圖2.jpg


    1. 唾液:取唾液樣品1ml加入1.5ml離心管中,離心3分鐘,沉淀雜質,取上清液200ul用于核酸提取。

    2. 全血:直接從采集的血樣中取200ul用于核酸提取。

    3. 血漿:1ml的抗凝血加入1.5ml離心管中,離心(3000rpm5分鐘,取上清液200ul用于核酸提取。

    4. 血清:1~2ml新鮮血液靜置待血清析出或離心(3000rpm5分鐘,取上清液200ul用于核酸提取。

    5. 拭子:適用于鼻拭子、肛門拭子、咽拭子、水泡拭子等。將棉拭子樣本置于1.5ml離心管中;加入1ml生理鹽水,生理鹽水以沒過棉簽頭為宜,浸泡并震蕩1分鐘。

    6. 精液:新鮮采集的精液,經室溫放置30min,至呈液化狀態;取其中1ml加入1.5ml離心管中,反復凍融不超過3次,以裂解細胞;離心3分鐘,取上清200ul用于核酸提取。

    7. 病毒培養液:直接吸取200μL原液用于核酸提??;或者使用生理鹽水將原液稀釋1:101:100,取200μL用于核酸提取。

    8. 活疫苗凍干粉:使用生理鹽水或疫苗稀釋液稀釋疫苗干粉(1mL/頭份),并充分搖勻,直接吸取200μL用于核酸提??;或使用生理鹽水將原液稀釋1:101:100,取200μL用于核酸提取。

    9. 飼料:對飼料樣本先進行物理粉碎,然后浸泡15~30分鐘,離心取上清液200μL用于核酸提取。

    10. 病料組織:剪取病料病變邊緣部位的組織,約米粒大小,置于1.5ml離心管中,吸取200ul生理鹽水加入離心管,研磨處理至組織塊完全分離,補充生理鹽水至500μL,充分混勻后,取200μL用于核酸提取,剩余的低溫留存用于復檢。


    為什么要進行核酸提???

    核酸提取純化的目的是為了除去PCR抑制物,增加靶核酸濃度、增加樣本的均一性,對于RNA的提取,要求更加嚴格。

    常見的三種DNA提取方法
    1. 一步法核酸免提取
    ——此方法簡單、快速,適用于臨床上組織、血清、血漿、拭子、體液、病毒培養物等樣品的快速提取與擴張。

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    2. 離心柱法提取核酸

    ——此方法克服了傳統核酸提取的缺點,提高了全血、精液等復雜樣本的核酸得率,減少血紅素等阻化物對PCR的抑制,適用于微量核酸的提取。

    圖4次.jpg

    圖5.jpg

    如進行RNA提取,需要注意RNA提取中RNase污染的控制,因為臨床樣本及實驗室環境中存在大量對RNA有強降解作用的RNase。RNase耐高溫,不易失活,我們必須控制RNase的污染,防止其對RNA的降解,這是成功提取RNA的關鍵。


    不管是在樣品的前處理,還是核酸提取過程,都涉及到實驗操作過程,而將操作過程標準化是實驗室操作人員最為核心最為重要的內容。

    非洲豬瘟病毒的實驗室檢測涉及到PCR實驗室的合理分區、標準的移液技術、正確的樣品前處理、核酸提取、PCR實驗室的清潔廢棄物處理及環境的定期污染監測等。目前僅剩下PCR實驗室的清潔廢棄物處理及環境的定期污染監測尚未推送。

    查看往期與非瘟現場檢測相關推送內容,一步一步將非瘟病毒的檢測過程標準化。
    【視頻】第二講:掌聲離心機的使用 | 實驗室基礎操作
    【視頻】第一講:移液器的使用 | 實驗室基礎操作
    【舉例】降低實驗室污染從合理的實驗室區間劃分操作開始
    【因素】影響非瘟檢測結果的首要環節:樣品的正確采集及保存

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